1)冰凍切片制備:建議用新鮮組織,否則組織細胞內部結構破壞,易使抗原彌散。選用干凈鋒利的刀片、組織一定要冷凍適度等,防止裂片和脫片。
2)組織切片固定:切好片風(fēng)干后立即用冰丙酮等固定液進(jìn)行固定5-10min,尤其要較長(cháng)時(shí)間保存的白片,一定要及時(shí)固定和適當保存。
3)血清封閉:為防止內源性非特異性蛋白抗原的結合,需要在一抗孵育前先用血清(與二抗來(lái)源一致)封閉,減弱背景著(zhù)色。血清封閉的時(shí)間是可以調整的,一般10-30min。
4)一抗孵育條件:在免疫組化反應中最重要,包括孵育時(shí)間和抗體濃度。一抗孵育溫度有幾種:4度、室溫、37度,其中4度效果更佳;孵育時(shí)間:這與溫度、抗體濃度有關(guān),一般37度1-2h,4度過(guò)夜(從冰箱拿出后37度復溫45min)。具體條件還要摸索。
5)二抗孵育條件:一般室溫或37度30min-1h,具體時(shí)間需要摸索,而濃度一般有工作液,若是濃縮液還要摸索濃度,一定要避光反應。但在免疫熒光中我們一般先把二抗濃度和孵育時(shí)間先定下,然后去摸索一抗濃度和孵育時(shí)間。最后,熒光素標記的二抗隨著(zhù)保存時(shí)間的延長(cháng),可能會(huì )有大量的游離熒光素殘留,需要注意配制時(shí)小包裝和并進(jìn)行適當的離心。
6)復染:目的是形成細胞輪廓,從而更好地對目標蛋白進(jìn)行定位。一般常用DAPI復染。
7)封片:為了長(cháng)期保存,我們一般用緩沖甘油等封片,此外還有專(zhuān)門(mén)的抗熒光萃滅封片液。避免產(chǎn)生氣泡,方法是直接在載玻片組織上滴一滴封片液,然后一手拿住蓋片某一拐角,而另一手拿對面的那個(gè)拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接觸到液體時(shí)為止;當發(fā)現液體接觸面在不斷彌散時(shí),則可以緩慢降低另一拐角,這樣一般不會(huì )產(chǎn)生氣泡。
8)切片清洗:為了防止一抗、二抗等試劑殘留而引起非特異性染色,所以適當地加強清洗(延長(cháng)時(shí)間和增多次數)尤為重要,一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均為5次*5min。
注意：(1)單獨沖洗,防止交叉反應造成污染。(2)溫柔沖洗,防止切片的脫落。我喜歡用浸洗方式;(3)沖洗的時(shí)間要足夠,才能徹底洗去結合的物質(zhì)。
9)PBS的PH和離子強度的使用和要求(建議PH在7.4-7.6,濃度是0.01M;中性及弱堿性條件有利于免疫復合物的形成,而酸性條件則有利于分解;低離子強度有利于免疫復合物的形成,而高離子強度則有利于分解) (5)拍照:有條件的話(huà)更好立即拍照,若不能及時(shí)拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和濕度。使用熒光顯微鏡注意嚴格按照熒光顯微鏡出廠(chǎng)說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作,不要隨意改變程序;應在暗室中進(jìn)行檢查;防止紫外線(xiàn)對眼睛的損害,在調整光源時(shí)應戴上防護眼鏡;檢查時(shí)間每次以1~2h為宜,超過(guò)90min,超高壓汞燈發(fā)光強度逐漸下降,熒光減弱;標本受紫外線(xiàn)照射3~5min后,熒光也明顯減弱或褪色;激發(fā)光長(cháng)時(shí)間的照射,會(huì )發(fā)生熒光的衰減和淬滅現象;所以最多不得超過(guò)2~3h;熒光顯微鏡光源壽命有限,標本應集中檢查,以節省時(shí)間,保護光源。天熱時(shí),應加電扇散熱降溫,新?lián)Q燈泡應從開(kāi)始就記錄使用時(shí)間。燈熄滅后欲再啟用時(shí),須待燈光充分冷卻后才能點(diǎn)燃。中應避免數次點(diǎn)燃光源。關(guān)閉汞燈至少在開(kāi)啟15-30分鐘后;標本染色后立即觀(guān)察,因時(shí)間久了熒光會(huì )逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存,可延緩熒光減弱時(shí)間,防止封裱劑蒸發(fā);使用的玻片等載體,都必須厚度均勻,無(wú)明顯的自發(fā)熒光,如果使用油鏡,還必須保證鏡油為無(wú)熒光鏡油;電源更好裝穩壓器,否則電壓不穩不僅會(huì )降低汞燈的壽命,也會(huì )影響鏡檢的效果。